現(xiàn)代顯微成像技術(shù)的基石，建立在去除熒光在樣品中的散射技術(shù)上，典型如共聚焦、多光子、光片成像、三維結(jié)構(gòu)光、組織透明化等。然而，基于光學(xué)的層切技術(shù)常常會(huì)帶來(lái)系統(tǒng)成本、成像時(shí)間與光毒性的提高，基于生物的層切技術(shù)又會(huì)帶來(lái)樣品處理復(fù)雜性的提高。此外，即使是最先進(jìn)的光學(xué)成像技術(shù)，在面對(duì)深層樣本的成像中，依然會(huì)由于深層散射而產(chǎn)生離焦背景，影響精細(xì)生物結(jié)構(gòu)的觀(guān)察。
為了提升各種場(chǎng)景下熒光成像的光學(xué)層切性能，我院生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心屈軍樂(lè)/北京大學(xué)席鵬合作團(tuán)隊(duì)另辟蹊徑，通過(guò)計(jì)算機(jī)視覺(jué)與熒光顯微的融合提出了一種暗通道光學(xué)層切算法（Dark sectioning），相關(guān)成果在Nature Methods以長(zhǎng)文（Article）的形式發(fā)表，題為“暗通道光學(xué)層切算法助力熒光圖像離焦背景去除”的研究論文。Dark sectioning僅用單幀圖像即可高效去除圖像的離焦背景，使顯微成像的信背比（SBR）和結(jié)構(gòu)相似性（SSIM）得到大幅提升，為深部生物組織研究、病理診斷及深層活體動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)開(kāi)辟全新可能。
研究背景：離焦信號(hào)成顯微成像“攔路虎”
熒光顯微鏡雖能捕捉細(xì)胞動(dòng)態(tài)，但樣本散射或離焦區(qū)域產(chǎn)生的背景噪聲會(huì)掩蓋關(guān)鍵細(xì)節(jié)。傳統(tǒng)解決方案如共聚焦顯微鏡、結(jié)構(gòu)光成像等技術(shù)雖有效，卻需復(fù)雜硬件或犧牲成像速度；而現(xiàn)有算法（如去噪、反卷積）難以精準(zhǔn)區(qū)分焦點(diǎn)內(nèi)外信息，易導(dǎo)致弱信號(hào)丟失或產(chǎn)生圖像偽影。
核心技術(shù)：靈感來(lái)自“圖像去霧”，單幀實(shí)現(xiàn)高精度光學(xué)切片
研究者從自然圖像的暗通道去霧中獲得靈感，融合暗通道先驗(yàn)與雙頻分離原理（圖1）：
暗通道先驗(yàn)：聚焦區(qū)域的暗通道值趨近于零，而離焦背景呈現(xiàn)非零波動(dòng)，借此精準(zhǔn)區(qū)分焦點(diǎn)內(nèi)外信息，廣泛應(yīng)用于自然圖像去霧任務(wù)中。
雙頻分離：將圖像分解為高頻（細(xì)節(jié)）和低頻（背景）成分，僅處理低頻部分以保留弱信號(hào)，最終融合生成高質(zhì)量圖像。
圖1.（a, b）自然圖像與離焦圖像的暗通道先驗(yàn)處理結(jié)果，（c）點(diǎn)拓展函數(shù)的大小差異導(dǎo)致暗通道圖像差異，以及（d）Dark sectioning處理前后的圖像對(duì)比。比例尺：4 μm。
首先，通過(guò)雙頻分離以保留圖像的弱小信號(hào)，僅對(duì)圖像的低頻部分進(jìn)行背景去除，并利用點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)優(yōu)化圖像塊尺寸，采用更低一級(jí)的低通濾波器模擬初始背景，最后通過(guò)單次或多次迭代去除背景以適用不同的成像場(chǎng)景。通過(guò)寬場(chǎng)-共聚焦，寬場(chǎng)-光層切，二維-三維結(jié)構(gòu)光，單光子-雙光子的聯(lián)合交叉驗(yàn)證（圖2），結(jié)果表明，Dark sectioning技術(shù)將SBR提升近10 dB，SSIM提高約10倍，效果媲美共聚焦顯微鏡，且適用于寬場(chǎng)、雙光子、光片顯微鏡等多種成像模式，甚至能優(yōu)化現(xiàn)有算法（如去卷積、超分辨成像），減少偽影。
圖2.交叉驗(yàn)證證明Dark sectioning技術(shù)的保真性能。（a）霉菌樣本的寬場(chǎng)-共聚焦成像，（b）小鼠腎臟微絲的多模態(tài)結(jié)構(gòu)光照明顯微成像，（c）小鼠神經(jīng)元鈣成像的單光子-雙光子成像。比例尺：（a, b）4 μm。
應(yīng)用場(chǎng)景：從腦科學(xué)到病理診斷的突破
Dark sectioning技術(shù)可應(yīng)用于不同的生物醫(yī)學(xué)成像場(chǎng)景。在神經(jīng)科學(xué)中，識(shí)別被背景掩蓋的小鼠腦組織深層神經(jīng)元，助力腦活動(dòng)追蹤。在病理分析中，對(duì)200微米厚的前列腺病理切片，精準(zhǔn)分割600多個(gè)細(xì)胞核，遠(yuǎn)超傳統(tǒng)方法的200個(gè)，為癌癥診斷提供更清晰依據(jù)動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)。此外，支持活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間成像，實(shí)時(shí)捕捉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體等動(dòng)態(tài)過(guò)程，且無(wú)需復(fù)雜硬件升級(jí)（圖3）。
圖3. Dark sectioning的典型應(yīng)用。（a）基于光片的小鼠全腦成像，（b）小鼠血管的小動(dòng)物活體成像，（c）合成孔徑雙光子小鼠神經(jīng)元成像，（d）前列腺組織三維光片成像與虛擬染色圖像。比例尺：（a）40 μm，（b）2 mm，（c）32 μm，（d）8 μm。
研究意義：低成本、高兼容，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展
Dark sectioning技術(shù)打破了傳統(tǒng)顯微成像在速度、成本與精度間的權(quán)衡，它像一款“智能濾鏡”，可無(wú)縫整合到現(xiàn)有設(shè)備中，為生物醫(yī)學(xué)研究提供更經(jīng)濟(jì)高效的解決方案。目前，研究團(tuán)隊(duì)已開(kāi)源代碼、提供了MATLAB程序/函數(shù)，基于Java的Fiji插件（https://github.com/Cao-ruijie/Dark-sectioning）供不同用戶(hù)測(cè)試使用，推動(dòng)技術(shù)普及。未來(lái)，該技術(shù)或與深度學(xué)習(xí)結(jié)合，進(jìn)一步革新醫(yī)學(xué)圖像分析，為疾病機(jī)制研究和臨床診斷開(kāi)辟新路徑。
在本項(xiàng)工作中，北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院教授席鵬、深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院教授屈軍樂(lè)為該論文的共同通訊作者，北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院博士生曹睿杰和北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院已畢業(yè)的李雅寧博士為共同第一作者，深圳大學(xué)生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心林方睿、張煒參與了本工作。此外，該工作還得到了華中科技大學(xué)費(fèi)鵬課題組、清華大學(xué)吳嘉敏課題組、南方科技大學(xué)李依明課題組、北京大學(xué)李長(zhǎng)輝課題組、北京大學(xué)盧閆曄課題組的重要支持與幫助。
本工作得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。
論文信息：Cao, R., Li, Y., Zhou, Y. et al. Dark-based optical sectioning assists background removal in fluorescence microscopy. Nat Methods (2025).https://doi.org/10.1038/s41592-025-02667-6
