近日，化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院劉翼振副教授課題組在 CRISPR 分子診斷技術(shù)領(lǐng)域取得重要進(jìn)展，為其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了關(guān)鍵技術(shù)方案。劉翼振副教授指導(dǎo)2022級(jí)碩士生鐘嘉玲在Nature Index期刊Analytical Chemistry接連發(fā)表2篇CRISPR診斷研究論文。
1.成果一以“A Single-Tube, Single-Enzyme CRISPR System (UNISON) with Internal Controls for Accurate Nucleic Acid Detection（一種帶有內(nèi)部控制的單管、單酶 CRISPR 系統(tǒng)（UNISON）用于精準(zhǔn)核酸檢測(cè)）”為題發(fā)表于國(guó)際分析化學(xué)領(lǐng)域頂級(jí)期刊Analytical Chemistry(Nature Index，中科院大類(lèi)一區(qū)Top)。劉翼振指導(dǎo)的2022級(jí)化學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士生鐘嘉玲為第一作者，副研究員陳勇、劉翼振為通訊作者，深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院為唯一作者單位。
成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列 （CRISPR） 和 CRISPR 相關(guān) （Cas） 蛋白已廣泛用于分子診斷。CRISPR診斷系統(tǒng)主要依靠熒光信號(hào)速率的上升來(lái)指示目標(biāo)核酸的濃度，容易受到酶活性、反應(yīng)條件、儀器性能等多種因素引起的系統(tǒng)誤差的影響。因此，建立內(nèi)部對(duì)照對(duì)于提高 CRISPR 系統(tǒng)的準(zhǔn)確性、可靠性和商業(yè)可行性至關(guān)重要。然而，與qPCR支持雙重?zé)晒馔ǖ缹?shí)現(xiàn)內(nèi)部控制不同，Cas蛋白的非特異性反式切割活性阻礙了內(nèi)部控制的建立。在這項(xiàng)研究中，作者構(gòu)建了帶有內(nèi)部控制的單管單酶CRISPR核酸檢測(cè)系統(tǒng) （UNISON）用于精準(zhǔn)核酸檢測(cè)。通過(guò)延伸 crRNA 并使用不同的熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)對(duì)其進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)了特異性靶點(diǎn)只能特異性切割相應(yīng)的折疊crRNA并產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號(hào)。這種設(shè)計(jì)將內(nèi)部對(duì)照功能整合到 CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乙型肝炎病毒臨床樣本的準(zhǔn)確可靠檢測(cè)，對(duì)構(gòu)建穩(wěn)定可靠的CRISPR診斷試劑體系具有重要意義。
論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c03403
2.成果二以“SPARC: An Orthogonal Cas12a/Cas13a Dual-Channel CRISPR Platform for Reliable SNV Identification and Mutation Confirmation（SPARC：一種用于可靠單核苷酸變異識(shí)別與突變確認(rèn)的正交 Cas12a/Cas13a 雙通道 CRISPR 平臺(tái)）”為題發(fā)表于國(guó)際分析化學(xué)領(lǐng)域頂級(jí)期刊Analytical Chemistry(Nature Index，中科院大類(lèi)一區(qū)Top)。劉翼振指導(dǎo)的2022級(jí)化學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士生鐘嘉玲為第一作者，劉翼振為通訊作者，深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院為唯一作者單位。
單核苷酸變異（SNVs）的快速可靠檢測(cè)對(duì)于精準(zhǔn)的病原體診斷、基因突變篩查及個(gè)性化醫(yī)療而言至關(guān)重要。然而，現(xiàn)有的基于 CRISPR 的核酸檢測(cè)平臺(tái)常存在信號(hào)解讀模糊、特異性受限及檢測(cè)流程復(fù)雜等問(wèn)題。在此，研究團(tuán)隊(duì)介紹了 SPARC（基于 Cas12a/Cas13a 的特異性精準(zhǔn)突變識(shí)別系統(tǒng)）—— 一種新型正交雙通道 CRISPR 檢測(cè)方法，該方法可顯著提升單核苷酸變異檢測(cè)的可靠性。
SPARC 整合了兩種酶：一是食酸菌屬 Cas12a（AsCas12a），其能特異性檢測(cè)保守區(qū)域并將其作為內(nèi)部參照；二是研究團(tuán)隊(duì)近期發(fā)現(xiàn)的 DNA 激活型頰纖毛菌 Cas13a（LbuCas13a），該酶無(wú)需設(shè)計(jì) crRNA 錯(cuò)配即可展現(xiàn)極高的內(nèi)在單核苷酸變異特異性。這種正交設(shè)計(jì)獨(dú)特地解決了真實(shí)單核苷酸變異與靶標(biāo)缺失之間常見(jiàn)的診斷模糊問(wèn)題。結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和 T7 核酸外切酶消化，SPARC 平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度可低至 1 aM。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)成功檢測(cè)并精準(zhǔn)區(qū)分乙型肝炎病毒（HBV）及具有臨床意義的 YMDD 耐藥突變，證實(shí)了該平臺(tái)強(qiáng)大的臨床適用性。這項(xiàng)研究提出了一種創(chuàng)新且多功能的基于 CRISPR 的解決方案，凸顯出其在推動(dòng)臨床診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的巨大潛力。
論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5c02141
